Parte 4. Effetti di campi elettromagnetici a frequenza estremamente bassa sull'inibizione delle cellule tumorali e sul possibile meccanismo
tripsin (tempo di digestione ottimale varia da cella a cella: 293 t, 1 min; hepg2, 1 min; a549, 2 min) . la digestione
è stato terminato nel mezzo e tutte le celle sono state aggiunte al tubo di centrifuga . Quindi, il foro è stato pulito con
Salina normale molte volte e aggiunta al tubo di centrifuga . In questo momento, il tubo di centrifuga conteneva tutte le celle .
Se le celle sono state lasciate nel foro è stato osservato al microscopio .
Cellule sospese: tutte le sospensioni cellulari sono state collocate in una provetta di centrifuga . I fori sono stati lavati con normale
salino più volte e collocato nella provetta di centrifuga . In questo momento, il tubo di centrifuga conteneva tutte le celle .
I pori sono stati osservati per il residuo cellulare al microscopio .
Conteggio: le cellule sono state centrifugate, risospese in un mezzo appropriato, diluito parzialmente e macchiate
Con Trypan Blue . Quindi, 10 µl di esso è stato iniettato attraverso il vetro di copertura .
Formula di calcolo: numero di celle/4 × volume × rapporto diluizione × 104 .
Le celle di ciascun gruppo sono state contate tre volte per un totale di tre gruppi .
rilevamento del valore ph .Il colorante a fluorescenza permeabile alla membrana BCECF AM e Fluorans sensibili al pH
cent sonda 2 ', 7'-bis-(2- carbossyetil) -5- carboxyfluorescein (Beyotime Biotechnology, Cina) per valutare
Il valore del pH intracellulare . le celle sono state coltivate in 96- piastre di pozzi ed esposte a un campo magnetico 5- Mt, 20- Hz Magnetic Field
Per 2 ore nei primi 2 giorni . Il giorno 3, le celle sono state risospese in 100 µl di 25 µm BCECF AM in 0,04% pluronic
F -127 soluzione di lavoro e incubata in un incubatore di CO2 a 37 ± 0 . 18 gradi per 1 h. Il surnatante è stato sostituito
con il buffer HHBS (AAT Bioquest, USA) e le celle sono state sottoposte a esposizione a campo magnetico per 2 h . il
Il surnatante è stato quindi sostituito con PBS e i valori di pH sono stati determinati usando la citometria a flusso FITC (FACS
Calibur, bd) .
Saggi di concentrazione di calcio intracellulare .Il colorante a fluorescenza permeabile alla membrana calbryte
520 AM (AAT Bioquest) è stato usato per valutare la concentrazione intracellulare di calcio . Le cellule sono state coltivate in
96- piastre di pozzo ed esposte a a 5- mt, 20- campo magnetico Hz per 2 h nei primi 2 giorni . il giorno 3, le celle erano le celle
risospeso in 100 µl di 5 µm calbryte 520 am in 0,04% pluronic f -127 soluzione di lavoro e incubata in a
CO2 Incubator a 37 ± 0 . 18 gradi per 1 h. Il surnatante è stato sostituito con tampone HHBS (Bioquest AAT) e il
Le celle sono state esposte al campo magnetico per 2 h . Il surnatante è stato quindi sostituito con PBS e l'intracel
I valori di concentrazione di calcio lulari sono stati determinati usando la citometria a flusso FITC (FACS Calibur) .
Determinazione del potenziale di membrana delle celle .Il potenziale di membrana è stato determinato usando il
colorante a fluorescenza potenziale sensibile a bis- (1,3- acido dibutilbarbiturico) trimetino ossonolo (dibac4) (3) (AAT BIO
Quest) . il colorante fluorescente diBac4 (3) permeato nelle cellule depolarizzate con un alto potenziale di membrana,
portando ad un aumento dell'intensità della fluorescenza intracellulare . dibac4 (3) è stato scaricato dall'iperpo
Celluledette e l'intensità della fluorescenza intracellulare diminuirono . le cellule sono state coltivate in piastre di pozzo 96- e
Exposto a un campo magnetico Hz 5-} Mt, 20- Hz per 2 h nei primi 2 giorni . le celle sono state coltivate in 100 µl di HHBS .
Il giorno 3, le cellule sono state risospese in 100 µl di 10 µm dibac4 (3) AM in 0,04% pluronico f -127 funzionante solu
zione e incubati in un incubatore di CO2 a 37 ± 0 . 18 gradi per 1 h. Il surnatante è stato sostituito con il tampone HHBS
(AAT Bioquest), e le celle sono state esposte al campo magnetico per 2 h . il surnatante è stato quindi sostituito con
PBS e i potenziali della membrana cellulare sono stati determinati usando la citometria a flusso FITC (FACS Calibur) .
Rilevamento ionico di sodio .Le celle sono state coltivate in 96- piastre di pozzo ed esposte a un 5- mt, 20- Hz magnetico
campo per 2 ore nei primi 2 giorni . il giorno 3, il mezzo è stato sostituito con 100 µl di HHBS e 100 µL di 10 µM
SBFI AM (Cayman Chemical) in uno 0 . 04% pluronic f -127 soluzione di lavoro. Il surnatante è stato sostituito con
HHBS Buffer (AAT Bioquest) dopo 4- H Incubazione in un incubatore di CO2 a 37 ± 0,18 gradi e le celle sono state esposte
sul campo magnetico per 2 h . lo ione di sodio è stato determinato con eccitazione 330/80 e emissione 528/20 usando a
Microplate Tester .
Rilevamento di ioni di potassio .Le celle sono state coltivate in 96- piastre di pozzo ed esposte a un 5- mt, 20- Hz mag
Campo netic per 2 ore nei primi 2 giorni . il giorno 3, il mezzo è stato sostituito con 100 µl di HHBS e 100 µl di
10 µm pbfi am (Cayman Chemical) in un 0 . 04% pluronic f -127 soluzione di lavoro. Dopo 4- H Incubation in a CO2
Incubatore a 37 ± 0,18 gradi, il surnatante è stato sostituito con tampone HHBS (Bioquest AAT) e le cellule erano
Esposto al campo magnetico per 2 h . La determinazione degli ioni di potassio è stata condotta a 330/80 Eccitazione e
528/20 Emissione usando un tester a micropiastra .
Trypan Blue Dyeing .293 T, le cellule Hepg2 e A549 nella fase di crescita logaritmica sono state digerite alla tripsina
e raccolte . celle Raji sono state raccolte direttamente . dopo la centrifugazione, le celle sono state colorate con il vitale
Dye Trypan Blue . Le celle vive sono state contate al microscopio ottico invertito (Carl Zeiss, Germania) . La cella
Sono stati determinati i tassi di inibizione della crescita e le curve rappresentative sono state tracciate . tasso di inibizione (%)=(num
ber di cellule nel gruppo di controllo -numero di cellule nel gruppo di campo magnetico) / numero di cellule nel controllo
Gruppo × 100%.
Analisi statistica .Tutti i dati sono stati espressi in media ± errore standard della media e analisi unidirezionale di
La varianza è stata utilizzata per il confronto tra più gruppi . Il test t Student è stato utilizzato per confrontare il trattato
contro gruppi non trattati . valore AP<0.05 indicated a statistically significant difference. The confirmatory results
a p<0.05 were obtained from repeating studies at least two times. Each set of experiments had three parallel
i campioni e ogni esperimento sono stati ripetuti tre volte .
Disponibilità dei dati
Tutti i dati sono presentati in questo articolo pubblicato e file supplementare .
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Riconoscimenti
Ringraziamo il professor Peter K . legge del Cell Therapy Institute, Wuhan, Cina, per l'assistenza tecnica .
Contributi dell'autore
J . s . ha progettato lo studio, eseguito la maggior parte degli esperimenti, analizzato i dati e ha scritto il manoscritto . H . W .}}
consigliato sulla progettazione dell'esperimento e aiutato con esperimenti . y . j ., x . j ., y. c e y . y . t .}
ed eseguito esperimenti . w . y . J . commentato sul manoscritto . z . M, K . c, x . d.. Z . l . c e j . m . w partici
Valicato nella produzione e nella misurazione di strumenti di campo magnetico . g . H . y . progettato e supervisionato il
Studia, interpretato i dati e scritto il manoscritto .
Finanziamento
Il fondo speciale per la prevenzione e il trattamento del cancro del foun scienza e tecnologia di Shanghai
Dation (Numero di sovvenzione CT20200517A) .
Interessi in competizione
Gli autori non dichiarano interessi concorrenti .
Ulteriori informazioni
Informazioni supplementariLa versione online contiene materiale supplementare disponibile su https: // doi . org/
10.1038/s41598-023-34144-5.
Corrispondenzae le richieste di materiali devono essere indirizzate a g . y .
Ristampe e informazioni sulle autorizzazioniè disponibile su www . natura . com/REPINTS .
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